La amiodarona 166

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líquidos de alta resolución ensayo cromatográfico de la amiodarona en plasma de rata Andrew S. Jun, Dion R. Brocks 1 Facultad de Farmacia. Universidad Western de Ciencias de la Salud, California, EE. UU. Manuscrito recibido 17 de octubre de 2001 Revisado 27 de noviembre de Aceptado 28 de noviembre de 2001 Propósito. Un método de cromatografía líquida de alta resolución se describe para la determinación de la amiodarona en plasma de rata. Métodos. Después de la extracción líquido-líquido, la separación de la amiodarona partir de componentes estándar y endógenos internos se llevó a cabo mediante cromatografía de fase inversa. La fase móvil, una combinación de fosfato de potasio monobásico, metanol y acetonitrilo, se llevó a cabo isocráticamente a través de una columna analítica C8. La detección UV fue a 254 nm para etopropazina, el patrón interno, y posteriormente se cambió a 242 nm para la detección de la amiodarona. Resultados. tiempo de ejecución de análisis fue de menos de 13 min. la recuperación media fue de 75 y 82 para más baja (0,5 m g / ml) y concentraciones más altas (5 m g / ml), respectivamente. El ensayo exhibió excelentes relaciones lineales entre proporciones de altura de pico y las concentraciones plasmáticas límite de cuantificación fue de al menos 0.035 m g / ml, basado en 100 m l de plasma de rata. Exactitud y precisión fueron 17 sobre el rango de concentración de 0,035 a 5 m g / ml. Conclusión. El ensayo se aplicó con éxito a la medición de las concentraciones plasmáticas de amiodarona en ratas que recibieron el fármaco por vía oral. Introducción La amiodarona 2-butil-3- (3,5-diyodo-4 b - diethylaminoethoxybenxoyl) benzofuran es una clase III agente antiarrítmico utiliza para tratar pacientes que sufren de un número de arritmias de la fibrilación ventricular o de origen (1). En los últimos años, la amiodarona se ha convertido en un fármaco antiarrítmico cada vez más útil y prescrito. Este aumento en el uso de amiodarona se ha visto impulsada en gran parte por la constatación de que los fármacos antiarrítmicos alternativos, como el agente de CI clase, encainida, son propensos a aumentar la mortalidad en pacientes con infarto de miocardio (2). La amiodarona posee un perfil farmacocinético interesante, con eliminación larga vida media, gran volumen de distribución, y la biodisponibilidad irregular y a veces incompleta (3, 4). Un número de ensayos analíticos para su uso en estudios farmacocinéticos están disponibles para la determinación de la amiodarona en muestras biológicas (Tabla 1). Tabla 1. Anteriormente publicado ensayos para la amiodarona en los fluidos sanguíneos. La mayoría de estos ensayos (3, 5 a 19) están destinados para su uso en el plasma humano, y típicamente requieren volúmenes de muestra de 0,5 a 1 ml de plasma (Tabla 1). Rata es un modelo animal comúnmente usado, y los estudios farmacocinéticos de la amiodarona en ratas han sido en su mayoría no la supervivencia en la naturaleza (17, 20, 21), que implica un animal por la concentración de la muestra, con la necesidad de volúmenes relativamente grandes (0,5 a 3 ml ) de sangre, suero o plasma por muestra individual. Los volúmenes de este tamaño son demasiado grandes para permitir la recogida de sangre en serie de la muestra en la supervivencia, la farmacocinética no terminal y estudios farmacodinámicos. Aquí se describe un método de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) para el ensayo de la amiodarona en pequeños volúmenes de plasma de rata. El método puede ser utilizado en estudios farmacocinéticos de la amiodarona en donde se desea la recogida de muestras, la sangre de serie múltiple en ratas individuales. Materiales y productos químicos experimentales amiodarona HCl y HCl etopropazina se obtuvieron de Sigma (St. Louis, MO, EE. UU.). El metanol, acetonitrilo, hexano (todos los grados de HPLC), trietilamina, fosfato de potasio (monobásico), fosfato de sodio (mono y dibásico) y ácido sulfúrico se adquirieron de Fisher Scientific (Fair Lawn, NJ, EE. UU.). Se obtuvo Agua para fines analíticos utilizando un sistema de purificación de agua Barnstead Nanopure Infinity (Dubuque, IA, EE. UU.). Tabla 2: Validación de datos para el ensayo de la amiodarona en plasma de rata. Condiciones cromatográficas El sistema de HPLC consistía en una bomba de cromatografía líquida Shidmadzu LC-10AT, muestreador automático SIL-10A y SPD-10A UV-VIS detector de absorbancia UV (Shimadzu, Kyoto, Japón). La recolección de datos, la integración y la calibración se llevaron a cabo utilizando cromatografía VP datos de la versión del sistema de software Clase 4.2 del ordenador (Shimadzu, Kyoto, Japón). Las separaciones cromatográficas de la amiodarona y el patrón interno (etopropazine) se llevaron a cabo usando un 100 mm 8 mm de diámetro interno Nova-Pak C8 cartucho columna analítica colocado en un módulo de compresión radial (Waters, Milford MA, EE. UU.). Un módulo de precolumna Guardia-Pak (Waters, Milford MA, EE. UU.) que contiene un inserto cartucho de SAO se colocan en serie justo antes de la columna analítica. La fase móvil consistió de metanol: acetonitrilo: 25 mM KH 2 PO 4: 3 mM de ácido sulfúrico: trietilamina 3,6 mM en una combinación de 63:12:25 v / v. Antes del uso, la fase móvil se desgasificó mediante el paso a través de un filtro de 0,45 m m. El móvil se bombeó a una velocidad de flujo isocrático de 1,5 ml / min a temperatura ambiente. Inmediatamente después de la inyección de la muestra en la HPLC, la longitud de onda de detección de UV se fijó a 254 nm. En 7 min después de la inyección, se cambió a 242 nm. Las longitudes de onda de 254 y 242 nm representaban la máxima UV de etopropazina y la amiodarona, respectivamente, en metanol. Estándar y soluciones de una solución madre de fármaco se preparó disolviendo 3,4 mg de HCl amiodarona en 32,2 ml de metanol, lo que representa 100 m g / ml de amiodarona base. Esta solución se almacenó a -20 C entre el uso de la amiodarona es conocida para permanecer estable durante al menos 3 meses en estas condiciones (5). Las soluciones patrón de trabajo se prepararon todos los días de la solución de stock de dilución secuencial con metanol para producir concentraciones finales de 10, 1 y 0,1 m g / ml amiodarona. Las soluciones madre de patrón interno se prepararon disolviendo 5 mg de HCl etopropazina en 100 ml de metanol (50 m g / ml). Esta solución se almacenó a -20 C entre el uso. procedimiento de extracción en un tubo de centrífuga de polipropileno de 1,5 ml, se añadió 100 m l de plasma de rata junto con 30 m l de solución de patrón interno. Las proteínas plasmáticas se precipitaron mediante la adición de 300 m l de acetonitrilo y, a continuación, los tubos se mezcló en vórtex. Los tubos se centrifugaron a continuación durante 2 min y el sobrenadante se transfirió cuidadosamente a nuevos tubos de vidrio usando pipetas Pasteur limpias. A cada tubo, se añadieron 300 ml de tampón fosfato (pH 5,9) y 3 ml de hexano. Después los tubos se mezcló en vórtex durante 30 s y se centrifuga a 3000 g durante 3 min. La capa de disolvente orgánico se transfirió a tubos nuevos y se evaporó a sequedad a vacío. Los residuos se reconstituyeron mediante 150 m l de fase móvil y alícuotas de 30 m l se inyectaron en el HPLC. La recuperación de la eficiencia de extracción se determinó mediante la comparación de las alturas de los picos de cantidades conocidas de amiodarona (sin extraer) en la fase móvil se inyecta directamente al pico alturas de las muestras que contienen la misma cantidad de amiodarona en el plasma después de la extracción. Recuperación se determinó a 0,5 m g / ml (n4) y 5 m g / ml (n4) de amiodarona. Calibración, exactitud y precisión de cuantificación se basó en las curvas de calibración construidas usando relaciones altura de pico del fármaco a patrón interno frente a la concentración nominal de drogas. Intra-día reproducibilidad se ensayó mediante el uso de cuatro concentraciones diferentes por día por cuadruplicado (0,035, 0,2, 1, y 5 m g / ml). El procedimiento se repitió en tres días separados para permitir la determinación de la precisión inter-día y la precisión. exactitud intradía se estimó en base al porcentaje de error medio, y la precisión entre días se calculó como la media de las determinaciones de precisión intra-día. La precisión, expresada en porcentaje, se evaluó mediante el cálculo de las desviaciones estándar relativas intra e inter-día. estudio en animales Con el fin de evaluar la capacidad del ensayo para medir las concentraciones de amiodarona en muestras in vivo, un estudio farmacocinético preliminar se llevó a cabo en dos ratas Sprague-Dawley macho (350-450 g cada uno). Bajo anestesia con halotano administrada utilizando una máquina de anestesia, una cánula Micro-renathane (Braintree científica, Braintree, MA) se implanta en la vena yugular derecha de cada animal. Una rata recibió una dosis oral única de 20 mg / kg de amiodarona en 1 suspensión metilcelulosa, mientras que el otro recibió / kg amiodarona HCl 25 mg en forma de bolo intravenoso. Para la dosificación intravenosa, el HCl amiodarona se disolvió en una mezcla de ácido acético: N, N-dimetilacetamida: polietilenglicol 400: 5 de dextrosa en agua (1: 3: 17: 30) para proporcionar una solución amiodarona HCl de dosificación de 10 mg / mL. muestras de sangre en serie se obtuvieron de la cánula durante 48 h, y las muestras de plasma resultantes se mantuvieron a -20 C hasta que se ensayaron. El área bajo la concentración de plasma frente a la curva de tiempo desde el momento de la dosificación a la última muestra de plasma (AUC 0-48h) se determinó usando la regla trapezoidal log-lineal. Figura 1: Los cromatogramas derivados de ensayo de A.) plasma de rata en blanco, B.) plasma de rata se trataron con 0,5 m g / ml amiodarona (AMI) y C) plasma de rata 3 h después de la administración oral de HCl 20 mg / kg amiodarona. IS indica la norma interna (etopropazina). Resultados picos correspondientes a patrón interno y la amiodarona eluido libre de sustancias que interfieren, en 3,2 y 10,8 min, respectivamente (Fig 1). Figura 2: concentración de plasma amiodarona vs. curvas de tiempo de las ratas dosificadas con A.) 25 mg / kg por vía intravenosa amiodarona HCl, y B.) 20 mg / kg amiodarona HCl a través de una sonda oral. El tiempo de ejecución de análisis fue de 13 minutos para cada muestra de plasma. Las eficiencias de extracción media de la amiodarona de 100 m l de plasma de rata, a concentraciones de 0,5 y 5 m g / ml, fueron 75,0 y 82,1, respectivamente. Para la construcción de curvas de calibración, los datos fueron ponderados por la concentración / factor de 1. Se obtuvieron excelentes relaciones lineales (r 2 0,994) entre las relaciones de la altura del pico y las correspondientes concentraciones de plasma en un intervalo de 0,035 a 50 m g / ml de la amiodarona. Una línea de regresión típica de la carrera de validación fue descrito por la concentración de la amiodarona (m g / ml) (pico de relación altura 0,00408) /12.825. Los coeficientes intradía y entre días de variación fueron de menos de 17 (Tabla 2). En el rango de concentraciones de 0,035 a 5 m g / ml, la precisión intradía oscilaron desde 84,8 hasta 114, y la precisión media interdiaria oscilaron desde 97,4 hasta 103 (Tabla 2). Basándose en estos datos, el límite inferior de cuantificación validado del método fue de 0,035 m g / ml basado en 100 m l de plasma de rata (Tabla 2). En la rata dado una dosis oral 20 mg / kg de amiodarona, las muestras de plasma se analizaron mediante el método de HPLC descrito (Fig 2). En este rata, la concentración máxima de plasma fue de 0,42 ng / ml a las 3 h después de la dosis. El área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo (AUC 0-48h) fue de 5,4 mg h / l. En la rata dado 25 mg / kg amiodarona HCl por vía intravenosa, la 0-48h AUC fue 9,4 mg h / l. El método de discusión de HPLC descrito aquí fue preciso y exacto, y es capaz de determinar las concentraciones de amiodarona en pequeños volúmenes de plasma de rata. El procedimiento de extracción era simple y el procedimiento utilizado un patrón interno disponible en el mercado (etopropazine). El método realizado bien con respecto a la reproducibilidad y precisión en el rango de concentraciones estudiadas (Tablas 1). Este método de ensayo fue rápida preparación de 30 muestras tomó menos de 2 h de la precipitación de proteínas inicial de colocación final de las muestras en los viales de HPLC inyector automático. El tiempo de ejecución de cromatografía fue de menos de 13 min. Los límites inferiores de la cuantificación y la pequeña muestra de plasma necesario para este ensayo fue ideal para estudiar la farmacocinética de amiodarona en la rata. Otros investigadores han descrito métodos analíticos para la determinación de la amiodarona en el plasma humano, (Tabla I). Sin embargo, estos métodos requieren el uso de volúmenes relativamente grandes de plasma (0,5 a 1,0 ml) y la reportados validados límites inferiores de cuantificación son típicamente mayor que 0,1 m g / ml. La concentración cuantificable validados más bajos que pudimos encontrar en la literatura fue 0,008 m g / ml, aunque (6) se requiere un volumen de plasma de 1 ml. Algunos de los ensayos reportados requieren cromatografía de fase normal con disolventes volátiles, que puede ser desventajoso desde el punto de vista de seguridad en el laboratorio y la salud ocupacional. El ensayo descrito aquí utiliza la cromatografía de fase inversa, que está menos cargado por tales cuestiones. Unos procedimientos se han reportado para el ensayo de la amiodarona en la rata (10, 17). En la mayoría de los estudios farmacocinéticos existentes con ratas, los animales se sacrificaron a los tiempos del sistema después de la dosificación con la droga, y relativamente grandes volúmenes de plasma o de sangre se sometieron a ensayo para la medición de contenido de fármaco (17, 20, 21). Para los estudios de supervivencia, los volúmenes de suero o plasma de 0,5-1,5 ml, lo que representa 1-3 ml de sangre, son demasiado grandes para el muestreo repetido de las ratas. Los presentes permisos de ensayo utilizan en estudios farmacocinéticos no terminales debido a su menor volumen de muestra (0,1 ml). Además, el ensayo es muy sensible, lo que permite una medición fiable de las concentraciones amiodarione tan bajas como 0,035 m g / ml. Algunos procedimientos de ensayo son capaces de medir simultáneamente desethylamiodarone en plasma. No hemos podido ensayar la capacidad de nuestro ensayo para medir este metabolito debido a la falta de disponibilidad del metabolito preformado. Debido a la mayor hidrofilicidad de la metabolito, sería de esperar para eluir en un momento anterior de la amiodarona en las condiciones de fase invertidos utilizados aquí. Sí observamos la presencia de un pico en los cromatogramas de 9,9 minutos en las muestras de rata in vivo. Debido a que este pico apareció creciendo en tamaño como el tiempo avanzaba, es posible que este pico representado desethylamiodarone o algún otro metabolito más polar de la amiodarona. En conclusión, hemos descrito un método de análisis capaz de medir la amiodarona en pequeños volúmenes de plasma. El ensayo se encontró que era adecuado para estudios farmacocinéticos en ratas que recibieron dosis orales de amiodarona, y se validó para la medición de concentraciones tan bajas como 35 ng / ml de amiodarona basado en 100 m l de plasma de rata. Presentado en parte en la Asociación Americana de Farmacéuticos Reunión Anual 2001 científicos y Exposición, Octubre 21-25, Denver, Colorado, EE. UU.. 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